Kes pertama manipulasi genetik dalam cicak ini telah mencipta organisma model yang boleh membantu mendapatkan pemahaman lanjut tentang evolusi dan perkembangan reptilia
CRISPR-Cas9 atau ringkasnya CRISPR adalah unik, cepat dan murah gen alat penyuntingan yang membolehkan pengeditan genom dengan memadam, menambah atau mengubah DNA. Akronim CRISPR bermaksud 'Ulangan Palindromik Antara Ruang Berkelompok'. Alat ini mudah dan lebih tepat daripada kaedah sebelumnya yang digunakan untuk menyunting DNA.
Alat CRISPR-Cas9 menyuntik organisma pada peringkat zigot (satu sel) dengan binaan DNA yang diperbuat daripada (a) enzim Cas9 yang bertindak sebagai 'gunting' dan boleh memotong atau memadam sebahagian DNA, (b) membimbing RNA - urutan yang sepadan dengan gen sasaran dan dengan itu membimbing enzim Cas9 ke lokasi sasaran. Sebaik sahaja bahagian sasaran DNA dipotong, jentera pembaikan DNA sel akan bergabung semula dengan helai yang tinggal dan, dalam proses itu, menyenyapkan gen yang disasarkan. Atau gen itu boleh 'diperbetulkan' dengan menggunakan templat DNA diubah suai baru dalam proses yang dipanggil pembaikan terarah homologi. Oleh itu, alat CRISPR-Cas9 membolehkan pengubahsuaian genetik dengan menyuntik penyuntingan gen larutan ke dalam telur yang disenyawakan sel tunggal. Proses ini menyebabkan perubahan genetik (mutasi) dalam semua sel berikutnya yang dihasilkan sehingga menjejaskan fungsi gen.
Walaupun CRISPR-Cas9 digunakan secara rutin dalam banyak spesies termasuk ikan, burung dan mamalia, setakat ini ia tidak berjaya dalam memanipulasi reptilia secara genetik. Ini terutamanya kerana dua halangan. Pertama, reptilia betina menyimpan sperma untuk jangka masa panjang dalam oviduk mereka sehingga sukar untuk menentukan masa persenyawaan yang tepat. Kedua, fisiologi telur reptilia mempunyai banyak ciri seperti kulit telur yang mudah lentur, kerapuhan tanpa ruang udara di dalamnya menjadikannya mencabar untuk memanipulasi embrio tanpa menyebabkan pecah atau kerosakan.
Dalam artikel yang dimuat naik pada bioRxiv pada 31 Mac 2019 penyelidik telah melaporkan pembangunan dan ujian cara untuk menggunakan CRISPR-Cas9 gen editing dalam reptilia buat kali pertama. Spesies reptilia yang dipilih dalam kajian adalah tropika cicak dipanggil Anolis sagrei atau lebih biasa anole coklat yang tersebar luas di Caribbean. Cicak dalam kajian itu dikumpul dari kawasan liar di Florida, Amerika Syarikat. Spesies ini sangat sesuai untuk kajian kerana saiznya yang kecil, musim pembiakan yang panjang dan masa purata yang agak singkat antara dua generasi.
Untuk mengatasi batasan yang sedang dihadapi dengan reptilia, penyelidik menyuntik mikro komponen CRISPR ke dalam telur yang tidak matang yang tidak disenyawakan semasa telur masih berada dalam ovari cicak betina sebelum persenyawaan. Mereka menyasarkan gen tyrosinase yang menghasilkan enzim yang mengawal pigmentasi kulit pada cicak dan jika gen ini dibuang cicak akan dilahirkan sebagai albino. Fenotip pigmentasi yang jelas ini adalah sebab untuk memilih gen tyrosinase. Telur yang disuntik mikro kemudiannya matang di dalam betina dan seterusnya disenyawakan secara semula jadi dengan sperma jantan yang diperkenalkan atau disimpan.
Akibatnya, empat biawak albino dilahirkan beberapa minggu kemudian mengesahkan bahawa gen tyrosinase dinyahaktifkan dan gen editing proses berjaya. Memandangkan anak tersebut mengandungi gen yang disunting daripada kedua-dua ibu bapa adalah jelas bahawa komponen CRISPR kekal aktif lebih lama dalam oosit ibu yang tidak matang dan selepas persenyawaan ia memutasi gen bapa. Oleh itu, cicak albino mutan mempamerkan tyrosinase yang dimanipulasi dalam gen yang diwarisi daripada ibu dan bapa kerana albinisme adalah sifat yang diwarisi daripada kedua ibu bapa.
Ini adalah kajian pertama yang berkesan menghasilkan reptilia yang diubah suai secara genetik. Penyelidikan boleh berfungsi dengan cara yang sama dalam spesies cicak lain seperti ular yang pendekatan semasa tidak berjaya setakat ini. Kerja ini boleh membantu mendapatkan pemahaman lanjut tentang evolusi dan perkembangan reptilia.
***
{Kajian ini sedang diserahkan untuk semakan rakan sebaya. Anda boleh membaca versi pracetak dengan mengklik pautan DOI yang diberikan di bawah dalam senarai sumber yang dipetik}
Sumber (s)
Rasys AM et al. 2019. Pracetak. CRISPR-Cas9 Penyuntingan Gen dalam Cicak Melalui Microinjection Oosit Tidak Disenyawakan. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
